Banca de DEFESA: PRICILA GOMES DA SILVA

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : PRICILA GOMES DA SILVA
DATA : 29/05/2024
HORA: 14:30
LOCAL: Sala Virtual Remota (Microsoft Teams) https://bit.ly/Def_MSc_PricilaSilva_PGBIOEXP
TÍTULO:

PURIFICAÇÃO DE UMA CATEPSINA D DE FÍGADO BOVINO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA SUA INTERAÇÃO COM UMA PLA2 DE Bothrops jararacussu.

PALAVRAS-CHAVES:

Protease Aspártica, Catepsina D, Fosfolipase A2, Complexo
proteína-proteína, funcionalização.

PÁGINAS: 54
RESUMO:

A enzima Catepsina D (CatD) e a Fosfolipase A2 (PLA2) possuem importante função
em diversas condições fisiopatológicas, estando envolvidas desde processos
neurodegenerativos e inflamatórios, até no ciclo de vida de diversos parasitas.
Moraes e cols (2022) demonstraram a interação da CatD humana com a BthTX-II,
uma PLA2 de Bothrops jararacussu, formando um complexo estável que modula a
atividade da CatD, tornando-a ativa em valores maiores de pH. Este fenômeno pode ser
capaz de auxiliar na elucidação de alguns eventos bioquímicos relacionados a CatD no
microambiente tumoral e Alzheimer. Considerando o alto custo de obtenção de CatD
humana para a continuidade dos estudos, o presente trabalho propõe a adaptação de
um novo protocolo para a obtenção de CatD a partir de fígado bovino (Bos indicus)
e a avaliação parcial de sua interação com uma BthTX-II, com a finalidade de
viabilizar futuros estudos biofísicos e estruturais. A metodologia utilizada para
obtenção da enzima consistiu em triturar 500g de fígado bovino, seguida de duas
etapas de solubilização/precipitação e posteriormente o fracionamento em coluna
de afinidade Sepharose + Pepstatina A previamente equilibrada com acetato de
sódio 0,1M pH 5,0 e eluida em gradiente step de 0 e 100% de Acetato de sódio pH
5,0 + NaCl 0,5M (tampão B) e Tris-HCl 0,1M pH 8,5 (tampão C) sob fluxo de
1mL/min, durante 40 minutos. Posteriormente, a amostra foi submetida a
cromatografia em coluna de fase reversa C18 (25 cm x 0,45, cm-Discovery)
previamente equilibrada com ácido trifluoracético 0,1% e eluida sob gradiente de 0
a 70% de ACN 99,9% (v/v) e TFA 0,1% (v/v) sob fluxo de 1mL/min. A avaliação da
massa relativa, grau de pureza e ponto isoelétrico foi observado em SDS-PAGE
12,5% e eletroforese bidimensional. O complexo enzimático foi avaliado quanto a
sua atividade enzimática sobre o substrato caseína em diferentes valores de pH,
submetidas a leitura em 660 nm em espectrofotômetro. A interação prevista entre
as proteínas foi observada in sílico através de docagem molecular usando a
ferramenta ClusPro e simulações de dinâmica molecular (MD) realizadas usando o
programa GROMACS com o campo de força CHARMM36m. A CatD de fígado
bovino apresentou massa molecular relativa de ~32 kDa, pI aproximado de 5,5 e
atividade ideal sobre caseína em pH 3 e temperatura 50oC. O complexo
CatD/BthTX-II apresentou modulação na sua atividade catalítica, estendendo sua
atividade sobre o substrato caseína até pH 6, sendo o valor ótimo de atividade em
pH 5. Os dados in sílico destacam que os resíduos de aminoácidos mais
predominantes relacionados a ligação das proteínas consiste em resíduos
hidrofóbicos. O complexo apresentou pouca variação na sua estabilidade sugerindo
uma significativa resistência estrutural. Desta forma, a CatD de fígado bovino forma
o mesmo complexo observado com sua análoga humana e a BthTX-II, o que
viabiliza sua utilização para subsequentes estudos estruturais.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 1522184 - LEONARDO DE AZEVEDO CALDERON
Externo à Instituição - LUIS ANDRE MORAIS MARIÚBA - FIOCRUZ
Externa à Instituição - SHARON ROSE ARAGAO MACEDO OLIVEIRA - UNIR